简介

1992年，Manfred Gossen和Hermann Bujard进行了开创性的研究，开发了尊龙凯时的Tet-off系统。相关研究成果以“Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters”为题发表在PNAS期刊。Tet-on/Tet-off系统是分子生物学和基因工程中最经典、应用最广泛的可诱导基因表达系统之一。该系统源于大肠杆菌的转座子Tn10四环素（Tetracycline, Tet）抗性操纵子（TetO），主要由Tet响应元件（TRE，由7个重复的TetO序列组成）、Tet阻遏蛋白（TetR）及其改造蛋白等组成，能够在真核细胞（如哺乳动物细胞）中精确、可逆、剂量依赖性地控制目标基因的开启或关闭。

基本原理

TetR能够与TetO特异性结合。当细胞内没有Tet时，TetR会与TetO结合，从而阻断下游抗性基因的表达。而当细胞内有Tet时，TetR的构象发生变化，使其与TetO分离，从而解除对抗性基因的抑制，导致抗性蛋白的表达，令细菌产生耐药性。

01 Tet-off系统原理

tTA是由TetR与单纯疱疹病毒VP16蛋白C端的一段转录激活结构域融合而成的蛋白，是四环素阻遏转录激活因子。当不存在多西环素（Doxcycline, Dox）时，tTA与TRE结合，启动下游基因的表达；而当Dox存在时，tTA的构象发生改变，从TRE上脱落，导致下游基因表达关闭。

02 Tet-on系统原理

反义tTA（rtTA）是由反义TetR（rTetR）及单纯疱疹病毒VP16蛋白C端的转录激活结构域融合而成，它的表型与tTA相反。rtTA只有在存在四环素时才激活TRE。当Dox不存在时，rtTA无法结合TRE，导致下游基因表达关闭；而当Dox存在时，rtTA的构象变化使其结合TRE，开启下游基因的表达。

关键特性与优势

01 高度严谨

在未诱导状态下（Tet-off有Dox；Tet-on无Dox），背景泄露表达非常低。而在诱导状态下（Tet-off无Dox；Tet-on有Dox），表达水平可接近强组成型启动子。

02 可逆性

通过添加或撤除Dox，可以快速、反复地开启或关闭基因表达，这对研究基因功能的动态变化至关重要。

03 剂量依赖性

基因表达的水平可通过Dox的浓度进行精细调控（在有效浓度范围内，浓度越高，Tet-on诱导越强，Tet-off抑制越强）。

04 快速响应

Dox作为小分子，能迅速穿透细胞膜（包括血脑屏障）。添加Dox后，基因表达通常在数小时（mRNA）到一两天（蛋白）内显著变化；撤除Dox后表达亦相应下降。

05 低细胞毒性

在常用浓度范围内，Dox对多数细胞类型的毒性很低，适合长期实验和体内研究。

06 广泛适用性

已成功应用于小鼠、大鼠等多种模式生物。

应用场景

1. 功能基因研究

1）在特定时间、细胞类型或组织中诱导表达某个基因，研究其过表达对细胞表型、信号通路、发育或疾病进程的影响。 2) 在转基因动物（如小鼠）中实现时空特异性的基因表达。例如，利用组织特异性启动子驱动rtTA/tTA表达，通过Dox给药控制目标基因在特定组织（如肝脏、大脑）和特定时间（如成年期）内的开启或关闭。

2. 神经科学研究

可结合光遗传学、钙成像等技术，研究神经系统的功能和机制。利用Tet-off系统与光敏蛋白结合，标记小鼠大脑中与恐惧记忆相关的细胞，通过光遗传激活这些细胞，研究记忆的编码、存储和提取机制。

客户案例分享

客户文章（IF=81）：Yu Y. M. et al. An accumbal microcircuit for the transition from acute to chronic pain. Curr Biol 2025 Apr 21; 35(8): 1730-1749 e5. doi:10.1016/j.cub.202502055. Epub 2025 Mar 19. PMID: 40112811。 尊龙凯时的病毒使用案例： AAV2/9-cfos-tTA-WPRE-hGHpA AAV2/9-TRE-tight-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-hGHpA AAV2/9-TRE3g-hM4D(Gi)-EGFP-WPRE-hGHpolyA AAV2/9-TRE3g-hChR2(E123T/T159C)-mCherry-WPRE-hGHpA 研究者通过tTA-TRE（Tet-Off）系统特异性标记了不同类型急性疼痛（如足底注射辣椒素/CAP、坐骨神经慢性压迫性损伤/CCI）。结果表明，尽管急性疼痛可以同时激活NAcS和NAcC神经元，但在疼痛消退后数天，只有NAcS神经元的再激活能够诱发小鼠的疼痛反应。这一发现表明，早期被疼痛激活的NAcS神经元在慢性疼痛发展中发挥重要作用，可能成为调控疼痛慢性化的一个潜在启动器。

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